产品规格 （CAT#: AC1040）

 基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline

产品说明

      EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：kan，赋予EHA101菌株和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。本公司生产的EHA101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pK7WGF2质粒（壮观霉素抗性）检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2.每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3.加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃，200 rpm振荡培养2~3小时。

4.6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时）。

备注

1、农杆菌相关抗生素配方：

2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

注意事项

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

4.利福平浓度不应高于25μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml 壮观霉素，若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。