• 说明书丨DE1045S-Stbl2 电激感受态细胞.pdf

产品规格（CAT#: DE1045）

基因型

F- mcrA Δ(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 lon gyrA96 thi supE44 relA1 λ^-Δ(lac-proAB)

产品说明

      Stbl2菌株来源于 JM109 E. coli strain，适合克隆不稳定插入片段 (正向重复序列，逆转录病毒序列等)；mcrA突变和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使该菌株更适于克隆甲基化的基因组序列；同时Stbl2也可用于慢病毒载体的构建。recA  1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。不存在lacI^qZΔM15，不可用于蓝、白斑筛选。Stbl2电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19检测转化效率可达10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1.0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.取-80℃保存的Stbl2电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

3.测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

4.对于连接产物，大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与Stbl2电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。

5.对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，然后与Stbl2电击感受态混合进行电击转化。

6.用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

7.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

8.2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃，225 rpm复苏60分钟

9.5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时或30℃培养箱过夜培养15-20小时。

S.O.C 培养基配方

2%        Tryptone                          

1.2%     Tryptone

2.4% Yeast Extract

4%        甘油

17mM   KH2PO4

72mM   K2HPO4

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 

注意事项

1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

3.当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

6.对于连接产物转化，部分公司的连接体系或重组体系(例如：Thermo，NEB公司的T4 连接酶系统，NEB，天根的50度反应重组系统)可以直接与EPI300电击感受态混合后电击转化，无需纯化，但DNA浓度不能过高，最好不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

7.混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

9.本产品仅作科研用途！